【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶?9（MMP?9）和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（CD147）在子宫内膜样腺癌组织表达及其与临床病理参数之间的关系。方法 采用逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）技术检测40例子宫内膜样腺癌和12例正常子宫内膜组织中MMP?9和CD147基因的表达水平，并分析其与子宫内膜样腺癌临床分期、组织学分级、肌层浸润深度及淋巴结转移等病理参数的关系。结果 子宫内膜样腺癌组织中MMP?9和CD147的表达均明显高于正常子宫内膜（t=9.46、7.86,P<0.05）。MMP?9在子宫内膜样腺癌中的表达水平与其临床分期、组织学分级、肌层浸润深度及淋巴结转移有关（t=3.27～16.20，P<0.05）；CD147在子宫内膜样腺癌中的表达水平与其临床分期、组织学分级及淋巴结转移有关（t=2.50～6.20,P<0.05），与肌层浸润深度无关（t=1.91,P>0.05）。子宫内膜样腺癌中CD147和MMP?9的表达呈正相关（r=0.443,P<0.01）。结论 MMP?9和CD147的高表达可能在子宫内膜样腺癌的发生发展中起重要作用，二者相互协同可能是促进子宫内膜样腺癌发生、浸润和转移的重要因素。
【关键词】 子宫内膜肿瘤 基质金属蛋白酶 9 逆转录聚合酶链反应
［ABSTRACT］ Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase?9 (MMP?9) and extracelluar matrix metalloproteinase inducer (CD147) in endometrioid adenocarcinoma and its relationship with clinical pathology. Methods Reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR) was used to detect MMP?9 and CD147 in endometrial tissue of 40 patients with the carcinoma and 12 normal endometrial tissue. The relationship between the expressions and clinical pathology was analyzed.Results The expression of MMP?9 and CD147 in the cancer was significantly higher than that of the normal tissue (t=9.46,7.86;P<0.05). Expression levels of both MMP?9 and CD147 in the cancer were closely related to the clinical phases, histological grade, and lymph node metastasis (t=3.27-16.20,P<0.05;t=2.50-6.20,P<0.05); the difference between them was that CD147 was not related to myometrial invasion. A positive correlation between the expression levels of MMP?9 and CD147 in the cancer was noted (r=0.443,P<0.01). Conclusion High expression of MMP?9 and CD147 may play an important role in the pathogenesis of endometrioid adenocarcinoma and their synergistic effect may act as important factors in promoting the invasion and metastasis of this cancer.
［KEY WORDS］ Endometrial neoplasms; Matrix metalloproteinase?9; Reverse transcription?polymerase chain reaction
子宫内膜癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，约占妇科肿瘤的20%～30%，近年来发病率和病死率均有上升趋势[1,2]，其侵袭和转移是造成子宫内膜癌病人死亡的主要原因。多项研究发现，基质金属蛋白酶（MMPs）对细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）的降解是肿瘤侵袭正常组织和开始转移的信号和重要途径，基质金属蛋白酶?9（MMP?9）是MMPs家族中的重要成员，是降解ECM主要成分Ⅳ型胶原最重要的酶。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（CD147）已证实在多种肿瘤组织中呈高表达，可刺激肿瘤周围间质细胞产生MMPs，从而参与肿瘤的发生发展。本研究采用逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）技术，检测40例子宫内膜样腺癌组织和12例正常子宫内膜组织中MMP?9和CD147基因的表达，探讨其与子宫内膜样腺癌、临床病理参数的关系及二者的相关性。
1 材料和方法
1.1 材料
收集青岛大学医学院附属医院妇科2004年5月～2006年6月收治的经病理检查确诊的子宫内膜样腺癌标本40例。临床分期按FIGO(2000年)分期标准,组织学分级按WHO分级标准。手术病理分期Ⅰ期18例，Ⅱ期12例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例；病理分级G1级12例，G2级18例，G3级10例；肌层浸润≤1/2者26例，>1/2者14例；淋巴结转移者8例，无淋巴结转移者32例。收集同期宫颈癌（Ⅰ期）病人经手术切除病理证实为正常子宫内膜标本12例作为对照。所有病人在术前均未接受放疗、化疗或性激素治疗。获取标本后，立即用液氮冷藏，以备提取RNA。
1.2 RT?PCR检测
1.2.1 总RNA的提取 按 Trizol试剂说明书提取组织总RNA。紫外线分光光度计测定所提取总RNA 的OD260/OD280 在1.8～2.0，并计算RNA 的浓度。
1.2.2 引物设计 MMP?9和CD147基因及内参照基因GAPDH均由Primer 5.0引物设计软件合成。MMP?9 上游引物5′?GGATGGGAAGTACTGGCGATTC?3′，下游引物5′?CACTTGGTCCACCTGGTTCAAC?3′，扩增片段长为478 bp。CD147上游引物5′?TTGAATGACAGCGCCACAGA?3′，下游引物5′?TGATCTTGTACCCCAGTC?3′，扩增片段长为301 bp，GAPDH碱基对长度为226 bp，上游引物5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC?3′，下游引物5′?GAAGGAAGGAAGATGGTGATGGGA?TTTC?3′。所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.3 RT?PCR 采用RT?PCR一步法，操作严格按德国QIAGEN试剂盒说明书进行。反应体系为25 μL，包括5×RT?PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix1 μL，5×Q?Soluition 5 μL，引物2.5 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，RNA 0.25 μg，去离子水补至25 μL，混匀后离心。反应条件如下：50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性15 min，进入循环；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，MMP?9，CD147和GAPDH的循环数分别是28、26、24；最后72 ℃延伸10 min。
1.2.4 RT?PCR产物的检测及半定量 在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳(100 V，30 min)后，凝胶扫描仪测定有无目的条带及条带吸光度值，以MMP?9或CD147条带的吸光度值与GAPDH的比值作为其相对表达含量。
1.2.5 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件包进行分析，计量资料用±s表示,统计方法采用t检验、Pearson相关分析。
2 结果
2.1 MMP?9和CD147基因在正常子宫内膜和子宫内膜样腺癌组织表达
子宫内膜样腺癌组MMP?9的表达也较正常子宫内膜组高，差异有统计学意义（t=9.46,P<0.05）；CD147在子宫内膜样腺癌组表达较正常子宫内膜组高，差异亦有统计学意义（t=7.86,P<0.05）。见表1、2，图1、2。
2.2 MMP?9和CD147基因在子宫内膜样腺癌组织的表达与临床病理参数之间的关系
MMP?9和CD147在术后病理分期为Ⅲ、Ⅳ期子宫内膜样腺癌组织中的表达水平均明显高于其在Ⅰ、Ⅱ期中的表达（t=16.2、4.36,P<0.05）。在肌层浸润组中，肌层浸润>1/2者MMP?9的表达水平明显高于肌层浸润≤1/2者（t=3.27，P<0.05），而CD147在子宫内膜样腺癌组中的表达水平与肌层浸润深度无关(t=1.91,P>0.05)。在组织分级组中，G2、G3级子宫内膜样腺癌组织中MMP?9和CD147的表达水平均明显高于G1级子宫内膜样腺癌组织（t=11.35、6.20，P<0.05）。在伴有淋巴结转移的子宫内膜样腺癌组织中，二者的表达水平均高于无淋巴结转移组（t=4.63、2.50，P<0.05）。见表2。
2.3 MMP?9和CD147在子宫内膜样腺癌组织表达的相关性
经Pearson相关分析显示，随着CD147表达的增强，MMP?9的表达也明显增高，两者呈显著正相关（r=0.443，P<0.01）。
表1 MMP?9和CD147基因在正常子宫内膜和子宫内膜样腺癌组织表达（略）
表2 子宫内膜样腺癌组织MMP?9和CD147基因表达与临床病理参数间的关系（略）
图1 MMP?9 mRNA电泳结果（略）
M为DL600,①、②为子宫内膜样腺癌组织,③、④为正常子宫内膜组织
图2 CD147 mRNA电泳结果（略）
M为DL600, ①、②为子宫内膜样腺癌组织,③、④为正常子宫内膜组织
3 讨论
子宫内膜癌的侵袭转移是多步骤、多因素参与的复杂过程，而肿瘤细胞对细胞外基质的降解是其侵袭转移的先决条件。MMP?9作为MMPs家族的重要成员，通过特异性降解基底膜上的Ⅳ型胶原，为肿瘤的浸润转移及肿瘤间质血管的新生提供条件。正常生理状态下，MMP?9参与细胞外基质的代谢，在胚胎发育、骨组织改建、排异及损伤愈合中发挥重要作用；病理状态下，其在肿瘤组织中的活性异常增高，具有降解细胞外基质、参与肿瘤的新生血管形成及调节细胞黏附等作用[3]，已成为研究热点之一。已有研究证明，在胃癌、食管癌及肺癌等多种恶性肿瘤中，MMP?9呈现过表达[4～6]。本研究显示，子宫内膜样腺癌组织中MMP?9的表达明显高于正常子宫内膜，提示MMP?9可能参与了子宫内膜样腺癌的发生发展。并且，子宫内膜样腺癌组织中MMP?9的表达水平随其组织学分级、肌层浸润深度及临床手术分期的升高而增加，且在有淋巴结转移组的表达水平显著高于无淋巴结转移组，这与KARAHAN等[7]报道的结果相一致。我们推测MMP?9的表达与子宫内膜样腺癌的恶性程度和浸润能力密切相关，MMP?9高表达的肿瘤细胞可能在浸润转移过程中的能力较强，突破各种屏障的能力较高，癌细胞可自身或诱导其他细胞分泌大量的MMP?9，破坏基底膜的完整性，导致癌细胞侵袭周围正常组织，并侵入血管和淋巴管发生转移。
CD147属免疫球蛋白超家族中高度糖基化的单次跨膜糖蛋白，是一种新的细胞表面黏附分子，介导细胞?细胞和细胞?间质的黏附作用[8]，广泛表达于恶性肿瘤细胞的胞膜上[9]。研究表明，CD147与肿瘤的演进密切相关，可通过上调透明质烷的产量来促进肿瘤的生长，通过诱导血管内皮生长因子的产生促进肿瘤血管的增生，也能通过刺激间质细胞及肿瘤细胞本身产生多种基质金属蛋白酶来降解细胞外基质和基底膜，从而促进肿瘤的浸润、转移[10]。有研究结果表明，CD147可与MMP形成复合物，使MMP紧密黏附在肿瘤细胞表面，从而加强MMP对肿瘤细胞间质的降解，使肿瘤周围的微环境更适于其向周围浸润及向远处转移[11]。据报道，在肝癌、皮肤癌、黑色素瘤及神经胶质瘤等多种肿瘤细胞中均发现CD147表达增高，且与肿瘤的浸润转移密切相关，但CD147在子宫内膜样腺癌中的研究少见。本研究结果显示，子宫内膜样腺癌组CD147的表达明显高于正常子宫内膜组，两者有显著差异，提示CD147可能在子宫内膜样腺癌的发生发展中起重要作用，这与苑媛等[12]研究结果相符。可能的机制是：CD147黏附于内皮细胞及纤维母细胞，刺激肿瘤周围间质成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶，促进内膜癌细胞的转移。本研究还表明，CD147在临床分期Ⅲ、Ⅳ期和组织分级低分化的子宫内膜样腺癌中，其表达水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期和中高分化的子宫内膜样腺癌。提示临床分期越晚、分化越差的子宫内膜样腺癌，其表达CD147的能力越强。CD147作用于邻近的癌细胞，相互诱导刺激MMPs的释放，降解更多的细胞外基质，在子宫内膜样腺癌的侵袭转移中发挥重要作用。
近年来研究结果表明，CD147的高表达可激活MMP?9降解细胞外基质，从而促进肿瘤的侵袭转移。文献报道，在乳癌[13]、卵巢癌[14]等多种恶性肿瘤中二者的表达存在明显相关性，其机制可能与肿 瘤细胞表面的CD147分子刺激和激活自身的MMP?9的释放而促进癌细胞的浸润转移有关[15]，但是其具体机制和信号转导途径仍需进一步研究。目前关于MMP?9 和CD147在子宫内膜样腺癌中的相关性报道较少。本研究中MMP?9和CD147基因均在子宫内膜样腺癌中呈高表达，且CD147表达增高时，MMP?9的表达也增高，这从基因水平表明了两者呈正相关，提示CD147可能促进MMP?9的产生，二者的协同作用共同促进子宫内膜样腺癌恶性细胞的增殖和转移。
综上所述，MMP?9和CD147在子宫内膜样腺癌的发生发展中起重要作用，是子宫内膜样腺癌侵袭转移的重要因素，二者联合检测对判断子宫内膜样腺癌的组织分化、恶性程度、肿瘤的侵袭力有指导意义。CD147作为MMP?9的上游分子，阻断其活化和功能可能更有效地抑制肿瘤的发展，可为子宫内膜样腺癌的临床治疗提供新思路。
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