【摘要】 目的 构建携带人alpha?突触核蛋白真核重组质粒，检测其在人神经母细胞瘤SK?N?SH细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法 PCR扩增alpha?突触核蛋白基因，产物纯化后与pcDNA3.1(+)载体进行连接反应, 构建pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白真核重组质粒。Lipofectamine法转染人神经母细胞瘤SK?N?SH细胞，RT?PCR方法检测SK?N?SH细胞中alpha?突触核蛋白mRNA的表达，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞存活率的影响。结果 酶切鉴定及基因测序证明人alpha?突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)载体中。RT?PCR 结果显示该表达载体转染SK?N?SH细胞后，细胞内alpha?突触核蛋白mRNA的表达水平明显增高，MTT方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论 alpha?突触核蛋白真核重组质粒构建成功, 并可在SK?N?SH细胞内表达，且对细胞的存活率不产生任何影响，从而为进一步研究alpha?突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用奠定了基础。
【关键词】 α突触核蛋白;质粒;帕金森病
[ABSTRACT] Objective To construct the eukaryotic expression plasmid of human alpha?synuclein gene and detect its expression in human SK?N?SH neuroblastoma cells and its effect on cell viability. Methods PCR was performed to amplify the entire fragment of human alpha?synuclein gene, and the amplified gene was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+) to form the new construct donated pcDNA3.1(+)/alpha?synuclein after purification. Liposome?mediated gene transfection method was used to transfect the human SK?N?SH cells. RT?PCR was used to detect the transient expression of alpha?synuclein gene. MTT assay was used to detect the changes in cell viability. Results Recombinant contained the correct and entire nucleotide sequence of human alpha?synuclein gene was found to be successfully constructed via restriction enzyme digestion and sequencing methods. Levels of alpha?synuclein mRNA were obviously increased in SK?N?SH cells with reconstructive plasmid transfection. However, no significant changes in cell viability were observed in these transfected cells. Conclusion The eukaryotic expression plasmid of human alpha?synuclein gene is successfully constructed and expressed in SK?N?SH cells. The cell viability is not affected. All these results establish a foundation for a further study of the role of alpha?synuclein in the pathogenesy of Parkinson disease.
[KEY WORDS] alpha?synuclein; plasmids; Parkinson disease
帕金森病(PD)是最常见的神经退行性疾病，发病率仅次于老年痴呆。其主要的病理改变是黑质致密带多巴胺能神经元脱失及伴发的纹状体轴突末梢多巴胺的耗竭[1]。PD的发病机制目前还不清楚，可能与老龄、环境毒素、遗传因素、氧化应激、兴奋性毒素、神经营养因子缺失等因素有关[2?3]。近年来，蛋白质的异常修饰和错误折叠在神经系统退行性疾病发病中的作用越来越受到关注，被认为可能是神经细胞变性死亡的关键环节。alpha?突触核蛋白为一种在健康人的脑组织中广泛分布的可溶性蛋白，被认为是PD发病机制中最重要的蛋白。alpha?突触核蛋白是路易小体的主要结构成分，其聚集与路易小体的形成及多巴胺能神经元的死亡密切相关[4]。但是目前alpha?突触核蛋白为何发生聚集形成路易小体以及聚集过程中对多巴胺能神经细胞的毒性作用还不十分清楚。因此，本实验拟构建一种携带人alpha?突触核蛋白的真核重组质粒，并转染人神经母细胞瘤SK?N?SH细胞，为探讨影响alpha?突触核蛋白聚集的因素以及alpha?突触核蛋白聚集的毒性作用机制提供基础。
1 材料和方法
1.1 材料
实验所需大肠杆菌菌株JM109和pcDNA3.1(+)载体均为本实验室保存。DMEM培养基购自Gibco公司，各种限制性内切酶、DNA连接酶购自中国宝生物工程(大连)有限公司。质粒小提试剂盒购自贝基生化科技有限公司，胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和RT试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。琼脂糖购自Bioasia生物技术公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SK?N?SH细胞购自上海中国科学院细胞库。其他化学试剂为国产分析纯。
1.2 alpha?突触核蛋白基因的PCR扩增
根据GenBank中已收录的alpha?突触核蛋白cDNA序列设计特异引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物:5′?CTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATG?3′(XhoⅠ酶切位点)，下游引物:5′?TCTAGAATCTCAAGAAACTGGGA?GCAAAG?3′(XbaⅠ酶切位点)。以SK?N?SH细胞全长cDNA为模版，PCR扩增alpha?突触核蛋白基因获得所需片段。扩增片段大小为545 bp。PCR循环条件:94 ℃变性1 min，56 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，共循环30次，最后72 ℃再延伸10 min。取2 μL扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳。
1.3 alpha?突触核蛋白真核表达载体pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白的构建及鉴定
alpha?突触核蛋白的PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化。将pcDNA3.1(+)空载体采用XbaⅠ和XhoⅠ酶切、回收纯化后将目的基因(alpha?突触核蛋白)和载体(pcDNA3.1(+))按3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA Ligase 进行连接反应，16 ℃下16 h以上，连接后24 h内将连接产物转化入感受态大肠杆菌JM109中，挑取阳性单克隆，在含氨苄青霉素的L培养液中摇菌培养过夜，裂解大肠杆菌，提取、纯化质粒，用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切连接产物，并用10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。将酶切鉴定正确的结果送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将构建好的鉴定无误的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白。
1.4 细胞培养
SK?N?SH细胞培养于含体积分数0.10胎牛血清、105 U/L青霉素和100 g/L链霉素的DMEM培养液中，置于体积分数0.05的CO2培养箱中传代培养，每2～3 d传代一次。
1.5 细胞转染
在转染前1 d，将处于对数生长期的SK?N?SH细胞按每孔106个细胞接种于6孔板中，使其在转染之日达到80%的融合度，使用LipofectamineTM 2000 将pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白真核重组转染入细胞中(参照脂质体转染说明书)，每孔按照DNA(μg)∶LipofectamineTM 2000=1∶5转染5 h后，更换为含体积分数0.10胎牛血清的完全新鲜培养基继续在培养箱中培养至48 h。同时，设立转染pcDNA3.1(+)的空载体对照组和不转染的空白对照组。
1.6 RT?PCR 检测外源alpha?突触核蛋白基因在SK?N?SH细胞中的表达
瞬时转染48 h后，将alpha?突触核蛋白真核重组质粒转染组、pcDNA3.1(+)的空载体对照组与不转染的空白对照组细胞用Trizol法提取总RNA，进行RT?PCR 反应，以检测alpha?突触核蛋白在转录水平的表达情况。alpha?突触核蛋白检测引物的上游序列为：5′?CAAGTGACAAATGTTGGAGGA?G?3′，下游序列为：5′?TTTCTTAGGCTTCAGGTT?CGTAG?3′，扩增片段长度为244 bp;内参照GAPDH引物的上游序列为：5′?TTCACCACCATGGAGAA?GGC3′，下游序列为5′?GGCATGGACTGTGGTCA?TGA?3′，扩增片段长度为236 bp。PCR 反应参数：94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循环36次。
1.7 MTT法检测细胞存活率
参照脂质体转染说明书，将处于对数生长期的SK?N?SH细胞按每孔104个接种于96孔板中并同时转染，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃培养箱中培养4 h，弃上清后每孔加入二甲基亚砜100 μL，用酶标仪测定570 nm处吸光度(A)值。
1.8 统计学处理
采用SPSS 12.0软件进行统计学处理，结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 重组质粒的酶切鉴定
重组质粒pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后，分别获得长度为545 bp和5 422 bp的DNA片段。见图1。
2.2 alpha?突触核蛋白真核表达载体测序
alpha?突触核蛋白真核重组质粒中alpha?突触核蛋白基因的测序结果进一步证实alpha?突触核蛋白克隆片段的插入方向正确，插入序列符合要求。测序发现克隆的alpha?突触核蛋白基因片段的编码区序列和GenBank中报道的序列完全一致。
2.3 外源alpha?突触核蛋白基因在SK?N?SH细胞中的表达
pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白转染SK?N?SH细胞48 h后，转染组alpha?突触核蛋白mRNA表达水平明显增高。见图2。
①DNA标准参照物DL2000;②pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白重组质粒经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切的片段;③DNA标准参照物DL15000。
①～③分别为正常细胞组、空载体转染组、pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白转染组内参照GAPDH; ④为DNA标准参照物DL2000;⑤～⑦分别为正常细胞组、空载体转染组、pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白转染组alpha?突触核蛋白。
图2 pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白转染SK?N?SH细胞中alpha?突触核蛋白基因的表达
2.4 重组质粒pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白在SK?N?SH细胞中表达后对细胞存活率的影响
正常细胞组、pcDNA3.1(+)载体转染组以及pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白转染组细胞存活率比较，差异无显著性(F=0.005，P>0.05)。
3 讨 论
在生理状态下，alpha?突触核蛋白是一种天然未折叠的可溶性蛋白，但其构象极易受外界环境的影响。低pH值、高温、有机溶剂、金属离子、盐溶液及杀虫剂等条件下可形成前熔球、α螺旋、β折叠、二聚体、寡聚体以及不溶性的聚集体等状态[5]。近年来研究发现，家族性与散发性PD中均伴有alpha?突触核蛋白含量的增高，并出现alpha?突触核蛋白聚集形成的路易小体，说明了alpha?突触核蛋白与PD的发病密切相关[6?7]。目前已有一些对alpha?突触核蛋白高表达的细胞模型的研究，有研究者认为，很多细胞高表达alpha?突触核蛋白后会产生明显的细胞毒性[8];但也有研究者认为，细胞内高表达alpha?突触核蛋白后只有在一些诱导其聚集的因素如氧化应激条件下才会产生毒性[9]。这些研究结果差异反映了人们对alpha?突触核蛋白的致病机制仍不十分清楚。PD病人脑内存在的氧化应激、炎症反应、高铁等状态被认为是其发病重要原因[10]，这些因素是否与alpha?突触核蛋白聚集有关呢? 泛素?蛋白酶体系统(UPS)是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径，它可以清除真核细胞中异常蛋白质，维持细胞内环境稳定。异常折叠的alpha?突触核蛋白也可通过此途径被降解。但研究表明，与其他部位相比，黑质中泛素酶活性降低33%～42%以及选择性的蛋白酶体亚单位活性丧失[11]。在散发型PD的黑质神经元中的26/20S蛋白酶体的α亚单位和20S蛋白酶体酶的活性都有损失[12]。过表达突变的alpha?突触核蛋白亦可降低蛋白酶体的活性，降低细胞对蛋白酶体抑制剂的耐受性, 引起线粒体损害和细胞凋亡[13]。alpha?突触核蛋白在脑中由可溶性的单体变为不可溶的聚集体很可能是PD的始发因素。
究竟是什么因素引起alpha?突触核蛋白的升高并出现聚集呢?alpha?突触核蛋白是通过何种途径抑制UPS的活性而引起自身的聚集呢?基于上述问题，本研究通过PCR法扩增真核细胞alpha?突触核蛋白序列，将PCR产物进行电泳分离，回收，纯化，将该片段克隆入pcDNA3.1(+)载体中，转化，提取，纯化质粒，经酶切鉴定、基因测序正确后，命名为pcDNA3.1(+)/alpha?突触核蛋白，将其转染入SK?N?SH细胞内观察到alpha?突触核蛋白的表达水平明显升高，且对细胞存活率并无明显的影响。
综上所述，本研究成功地构建了alpha?突触核蛋白真核表达载体，并转染至SK?N?SH细胞， 通过RT?PCR方法检测其在SK?N?SH细胞中的表达。本文结果为探讨影响alpha?突触核蛋白聚集的因素以及alpha?突触核蛋白聚集的毒性作用机制提供了研究基础。
【参考文献】
[1]LORENZL S. Parkinson’s disease and atypical Parkinson syndromes [J]. MMW Fortschr Med, 2009,151(51/52):39?40.
[2]刘珂,滕继军,王修海. 散发性帕金森病Parkin基因突变检测[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45 (2)：104?106.
[3]TAKAHASHI R, KAWAMATA J, TAKEUCHI H. Pathogenesis of sporadic Parkinson’s disease: contribution of genetic and environmental risk factors[J]. Rinsho Shinkeigaku, 2009,49(11):885?887.
[4]B?N?R, ANTIC S, BUDISIC M, et al. Parkinson’s disease[J]. Acta Clin Croat, 2009,48(3):377?380.
[5]UVERSKY V N. Neuropathology, biochemistry,and biophy?sics of alpha?synuclein aggregation[J]. J Neurochem, 2007,103:17?37.
[6]CHIBA?FALEK O, LOPEZ G J, NUSSBAUM R L. Levels of alpha?synuclein mRNA in sporadic Parkinson disease patients[J]. Mov Disord, 2006, 21:1703?1708.
[7]SINGLETON, FARRER M, JOHNSON J. alpha?Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease[J]. Science, 2003,302:841.
[8]OSTREROVA?GOLTS N, PETRUCELLI L, HARDY J, et al. The A53T alpha?synuclein mutation increases iron?dependent aggregation and toxicity[J]. J Neurosci, 2000,20:6048?6054.
[9]JUNN E, MOURADIAN M. Human alpha?synuclein over?expression increases intracellular reactive oxygen species levels and susceptibility to dopamine[J]. Neurosci Lett, 2002,320:146?150.
[10]姜宏,谢俊霞. 黑质内注射FeCl3对大鼠纹状体多巴胺释放量及含量的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2002,38(2)：103?106.
[11]MCNAUGHT K S, JENNER P. Proteasomal function is impaired in substantia nigra in Parkinson’s disease[J]. Neurosci Lett, 2001,297:191?194.
[12]GONG B, CAO Z, ZHENG P. Ubiquitin hydrolase Uch?L1 rescues beta?amyloid?induced decreases in synaptic function and contextual memory[J]. Cell, 2006,126:775?788.
[13]TANAKA Y, ENGELENDER S, IGARASHI S, et al. Inducible expression of mutant alpha?synuclein decreases proteasome activity and increases sensitivity to mitochondria?dependent apoptosis [J]. Hum Mol Genet, 2001,10(9):919?926.
